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Roepat
(Str: dp. 16 100; 1. 466'0", b. 55'11", dr. 28'9", s. 11 k.; cpl. 70; a. 1 5", 1 3")
Roepat (Id. No. 2536), construit en 1914 par William Hamilton & Co., Ltd., Glasgow, Écosse, pour servir en tant que navire de transport d'animaux Duteh, a été saisi par les douaniers américains, repris et mis en service comme Naval Overseas Navire du service des transports le 17 mai 1918 à New York.
Après la remise en état et le remeublement, Roepat a chargé une oreille de fournitures militaires générales et a navigué le 2 juin en convoi pour Brest et Saint-Nazaire où elle a déchargé sa cargaison. Elle est revenue à New York en convoi le 30 juillet.
En chargeant des fournitures d'armée à Norfolk, elle a navigué dans le convoi de New York le 17 août pour Marseille où elle est arrivée le 6 septembre pour décharger sa cargaison. Elle est revenue à New York le 18 octobre pour subir des réparations et charger la cargaison militaire pour le Verdon où elle est arrivée le 18 novembre. Elle est revenue à Norfolk le 22 décembre.
Chargeant une cargaison pour le Shipping Board Account à Baltimore, il s'est ravitaillé à la Nouvelle-Orléans et a navigué depuis ce dernier port le 5 février 1919 pour Cette via Newport News. Débarquant sa cargaison de blé et de grain consignée au gouvernement suisse le 4 mars, elle est revenue à New York le 6 mai et a subi des réparations.
Roepat a navigué le 24 mai pour Portland, Maine où elle a chargé une cargaison pour le Conseil d'Expédition et a navigué le 29 pour Amsterdam où elle est arrivée le 28 juin. Le 30 juin, Roe pat a été mis hors service et rendu à son propriétaire, Nederland Stoomvaart Maats chappij.
Introduction à la répétition courte en tandem
J'espère que tout le monde reste en sécurité et en bonne santé en ces temps malheureux. Mon dernier poste concernait le fait d'être un nouveau diplômé en MLS et de commencer ma carrière en tant que technologue moléculaire au laboratoire de transplantation de la Northwestern University. Le temps passe définitivement !
Aujourd'hui, je vais fournir une introduction de base sur un test sur lequel j'ai récemment été formé et appelé Short Tandem Repeat (STR). Si vous jetiez un coup d'œil à votre génome, il serait jonché de nombreuses séquences répétitives. Bien qu'il existe de nombreuses classifications différentes de séquences répétitives, les STR sont un type de séquence répétitive en tandem où chaque répétition a une longueur d'environ 2 à 7 nucléotides. 1,2,3 STR est bien connu dans la science médico-légale pour aider à identifier un suspect sur une scène de crime lorsque différentes sources d'ADN sont présentes. Pourtant, ses applications sont nombreuses - de la confirmation de lignée cellulaire, aux tests paternels et jusqu'à l'analyse du chimérisme ! 4
Image 1. Électrophérogramme représentant deux allèles différents (11 et 17) dans 1 locus (D6S1043). L'allèle 11 a 11 répétitions et l'allèle 17 a 17 répétitions.
Les STR sont polymorphes, une caractéristique utile parmi tant d'autres, ce qui rend son utilisation pour identifier la source d'ADN particulièrement avantageuse. Un allèle STR est défini par le nombre de fois que la séquence répétée, définie ci-dessus, se répète. (Photo 1). 1 Les individus sont soit hétérozygotes soit homozygotes à chaque locus. Au fur et à mesure que le nombre de loci STR évalués augmente, le pouvoir statistique de discrimination augmente et la probabilité qu'un autre individu ait le même profil devient de plus en plus improbable et la détection de petites différences augmente. 3,4 Dans notre laboratoire, nous évaluons un total de 21 loci différents !
De plus, dans notre laboratoire HLA, nous utilisons STR pour surveiller l'état du chimérisme chez les patients qui ont subi une allogreffe de cellules souches. Avant leur greffe, les patients sont appariés à un donneur via leur système HLA (différent de STR). Une fois qu'une correspondance HLA est confirmée, nous utilisons la pré-transplantation du patient et l'échantillon du donneur pour générer des allèles informatifs STR. Les allèles informatifs sont des allèles présents uniquement chez le receveur et non chez le donneur. Ces allèles sont importants car les greffes de cellules souches remplacent la moelle du receveur et la détection de l'ADN du receveur dans les échantillons post-greffe est cruciale pour identifier le rejet ou la rechute de sa maladie. De plus, les loci qui contiennent des allèles informatifs sont définis comme des loci informatifs, ce sont les loci ensuite utilisés pour identifier le pourcentage de chimérisme (Image 2).
Image 2. Le donneur et le receveur (pré-greffe) sont représentés dans les deux premiers électrophérogrammes. Les balises vertes « D1R » représentent les allèles partagés, les balises bleues « D1 » représentent les allèles spécifiques du donneur et les balises brunes « R » représentent les allèles spécifiques du receveur. Dans le premier locus, AMEL, il n'y a pas d'allèles informatifs et ce n'est donc pas un locus informatif. Dans le locus suivant, D3S1358, il y a un allèle partagé, 15, un allèle donneur, 17, et un allèle informatif receveur, 18. Les loci informatifs ont des allèles informatifs receveurs et peuvent détecter la présence d'ADN receveur dans un échantillon – dans dans ce cas, tous les loci suivants après AMEL sont des loci informatifs. CD3 (post-transplantation) est représenté sur le troisième électrophérogramme. Dans cet exemple, il est clair que le patient a une sorte d'échec de greffe ou de réapparition de sa maladie parce que ses propres cellules, au lieu de celles du donneur, sont présentes.
Lorsque les cellules receveuses commencent à réapparaître, nous pouvons détecter les pics d'allèles relatifs et les attribuer au receveur ou au donneur en se référant aux allèles informatifs. Les pics d'allèles sont ensuite utilisés via des équations dans notre logiciel qui mesurent la surface sous ces pics définis, puis calculent un chimérisme en pourcentage du donneur. Une fois ce rapport informatif créé, nous pouvons comparer tout échantillon post-transplantation en cours pour déterminer le statut de chimérisme du patient (Image 2).
Assez intéressant, nous n'isolons pas simplement l'ADN du buffy post-échantillon comme nous le ferions avec d'autres échantillons. Au lieu de cela, nous séparons chaque échantillon de poste en un total de trois sous-échantillons. Le premier est simplement le sang périphérique du patient - rien d'extraordinaire. Les deux autres sont isolés du reste du sang périphérique qui n'a pas été utilisé dans deux lignées cellulaires distinctes – les lymphocytes (CD3+) et les myélocytes (CD33+). Ce processus est extrêmement laborieux, pouvant traiter un ensemble de 8 à 12 patients à la fois et chaque ensemble prenant jusqu'à 4 à 5 heures.
Le processus commence par aliquoter le sang périphérique pour l'isolement de l'ADN (échantillon 1) et prendre le reste et le superposer sur un milieu de séparation des lymphocytes (LSM). Puis récolter la couche de lymphocytes/globules blancs du LSM centrifugé. Nous ajoutons ensuite des cocktails de sélection d'anticorps CD3 et CD33 et des billes magnétiques. Ensuite, nous effectuons une série de lavages avec des aimants et finissons par obtenir nos populations de cellules CD3 et CD33 purifiées. Leur pureté est déterminée par cytométrie en flux, un élément important pour confirmer que nos sous-ensembles de leucocytes ne sont pas contaminés par d'autres populations de leucocytes - car la contamination irait à l'encontre de l'objectif d'analyser différentes lignées.
Enfin, nous prélevons l'ADN isolé des trois sous-échantillons et l'amplifions avec des amorces spécifiques et des marqueurs fluorescents par PCR. Ensuite, les échantillons sont chargés sur un instrument d'électrophorèse capillaire. Cet instrument détectera chaque longueur de fragment, définie par les amorces et les répétitions à l'intérieur, et sera capable d'identifier ces fragments par la taille, les marqueurs fluorescents, les lasers et les détecteurs. L'instrument générera ensuite des données que nous pourrons transmettre à notre plate-forme d'analyse, ChimerMarker. Grâce à cela, nous pouvons analyser les données et générer nos rapports cliniques.
Bien qu'extrêmement chronophage, le chimérisme spécifique à la lignée est essentiel dans la greffe de cellules souches, car il est plus informatif et sensible que l'analyse totale des leucocytes - étant plusieurs grandeurs plus sensibles que l'analyse du sang périphérique seul. Il permet la détection précoce de petites populations de cellules chimériques qui pourraient autrement passer inaperçues, car un sous-ensemble dans le sang périphérique peut « masquer » un autre sous-ensemble qui a un pourcentage croissant de cellules receveuses. Le diagnostic de ces populations de cellules chimériques à petites cellules le plus tôt possible est essentiel pour les interventions thérapeutiques et la réduction des rejets de greffe. 2,5,6
De plus, non seulement leur détection est importante, mais grâce à notre analyse, nous pouvons calculer le pourcentage de cellules donneuses et de cellules receveuses. Nous rapportons souvent le pourcentage de chimérisme du donneur (%). Par exemple, un patient à 322 jours après la transplantation pourrait avoir un chimérisme du donneur de 96 % dans son sang périphérique, 100 % dans sa lignée CD33 et 73 % dans sa lignée CD3. Ensuite, au jour 364 post-greffe, ils peuvent alors être à 100 % dans leur sang périphérique, à 100 % dans leur lignée CD33 et à 92 % dans leur lignée CD3. Deux choses à noter dans cet exemple sont que les pourcentages changent (augmentation du chimérisme des donneurs dans ce cas) et que le sang périphérique exprimait 100% de chimérisme dans le deuxième échantillon à 364 jours, mais quand on regarde spécifiquement la sous-population CD3. à 364 jours, il y avait encore 8 % de cellules receveuses présentes (image 3 et 4).
Image 3. Échantillons à 322 jours après la transplantation. Le sang périphérique rapporte 96% de chimérisme du donneur. CD3 et CD33, purifiés à partir de sang périphérique, rapportent respectivement 73 % et 100 % de chimérisme du donneur. 
Image 4. Échantillons à 364 jours post-greffe, même patient que dans l'image 3 ci-dessus. Le sang périphérique rapporte 100 % de chimérisme du donneur. CD3 et CD33, purifiés à partir de sang périphérique, rapportent respectivement 92 % et 100 % de chimérisme du donneur.
Certaines études se sont concentrées non seulement sur les tendances des pourcentages changeants, mais aussi sur leur constellation relative de pourcentages. Par exemple, une étude a révélé qu'une augmentation du nombre de cellules CD3 receveuses avait un facteur prédictif accru de rejet de greffe. Il a également été constaté que d'autres populations de sous-leucocytes augmentaient ce pouvoir prédictif. 5 Plus encore, certaines études ont examiné le chimérisme et son utilité pour prédire la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD). Cette maladie est définie par des leucocytes du donneur attaquant les leucocytes et les tissus du receveur. Grâce à ces découvertes et à d'autres, le potentiel et l'applicabilité de la surveillance du chimérisme sont extrêmement cruciaux pour les soins aux patients pendant la progression de leur greffe. 2,5,6,7
Alors que la prise de greffe est un processus très dynamique, variant selon les individus et les types de maladie, la surveillance de la prise de greffe est un moyen de surveiller et, en fin de compte, d'influencer les approches thérapeutiques. 2,5,6 Je suis fier de pouvoir contribuer à la merveilleuse équipe de la Northwestern University et je m'efforce d'en apprendre davantage sur le processus, à la fois clinique et en laboratoire. Dans les prochains articles, j'espère entrer plus en détail sur le processus et les autres tests que nous effectuons.
Merci d'avoir lu! Jusqu'à la prochaine fois! Portez-vous bien et en sécurité en ces temps incertains!
- Technologies de la vie. 2014. Analyse de fragments d'ADN par électrophorèse capillaire. Thermo Fisher Scientific. http://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf.
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- Clark, JR, Scott, SD, Jack, AL, Lee, H., Mason, J., Carter, GI, Pearce, L., Jackson, T., Clouston, H., Sproul, A., Keen, L. , Molloy, K., Folarin, N., Whitby, L., Snowden, JA, Reilly, JT et Barnett, D. (2015), Monitoring of chimerism after allogeneic heematopoietic stem cell transplantation (HSCT): Technical recommandations for the use of Short Tandem Repeat (STR) based techniques, au nom du National External Quality Assessment Service for Leucocyte du Royaume-Uni Groupe de travail sur l'immunophénotypage sur le chimérisme. Br J Haematol, 168 : 26-37. doi: 10.1111/bjh.13073
- Analyse de répétition en tandem courte dans le laboratoire de recherche. (2012). Extrait le 10 avril 2020 de https://www.promega.com/resources/pubhub/short-tandem-repeat-analysis-in-the-research-laboratory/
- Breuer, S., Preuner, S., Fritsch, G., Daxberger, H., Koenig, M., Poetschger, U., … Matthes-Martin, S. (2011). Test de chimérisme du receveur précoce dans les lignées de cellules T et NK pour l'évaluation du risque de rejet de greffe chez les patients pédiatriques subissant une allogreffe de cellules souches. Leucémie, 26(3), 509-519. doi: 10.1038/leu.2011.244
- Buckingham, L. (2012). Diagnostic moléculaire : fondamentaux, méthodes et applications cliniques. Philadelphie : Compagnie F.A. Davis.
- Rupa-Matysek, J., Lewandowski, K., Nowak, W., Sawiński, K., Gil, L., & Komarnicki, M. (2011). Corrélation entre la cinétique du chimérisme CD3 et l'incidence de la maladie du greffon contre l'hôte chez les patients subissant une transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques. Procédure de transplantation, 43(5), 1915-1923. doi: 10.1016/j.transproceed.2011.02.011
-Ben Dahlstrom est un récent diplômé du programme NorthShore University HealthSystem MLS. Il travaille actuellement en tant que technologue moléculaire pour la Northwestern University dans leur laboratoire de transplantation, effectuant le typage HLA sur des greffes de moelle osseuse et d'organes solides. Ses intérêts comprennent la microbiologie, la biologie moléculaire, l'immunologie et la banque de sang.
Discussion
La première technologie de typage ADN introduite au milieu des années 1980 était RFLP. La méthode RFLP de typage de l'ADN impliquait des unités centrales de séquences constituées de 30 à 100 nucléotides qui sont présents dans de nombreuses répétitions (VNTR). La méthode RLFP de typage de l'ADN nécessite un ADN génomique intact en grande quantité (20 à 30 mg). Cependant, les spécimens biologiques reçus dans un laboratoire de médecine légale sont généralement assaillis par l'environnement et, parfois, seules de petites quantités d'ADN peuvent être obtenues. Par conséquent, dans de nombreuses situations, la méthode RFLP n'a pas pu être appliquée.
La méthode de typage ADN actuellement utilisée est le typage STR. Dans cette méthode, de nombreux loci composés d'unités centrales de nucléotides répétés jusqu'à une longueur de 80 à 400 paires de bases peuvent être co-amplifiés et les résultats peuvent être obtenus le même jour par des analyses automatisées de fragments d'ADN. Cette technologie est plus supérieure que la méthode RFLP car elle nécessite des quantités infimes d'ADN (0,5 à 1 ng) et des échantillons dégradés peuvent également être testés.
L'analyse de l'ADN a contribué à obtenir des condamnations dans des centaines de crimes violents, des homicides aux agressions. Elle a également permis d'éliminer des suspects et a conduit à la disculpation et à la libération de personnes précédemment condamnées. L'ADN peut focaliser les enquêtes et raccourcira probablement les procès et conduira à des plaidoyers de culpabilité. Cela pourrait également dissuader certains contrevenants de commettre des infractions graves. L'utilisation accrue des preuves génétiques médico-légales entraînera des économies à long terme pour le système de justice pénale.
En stockant les données ADN dans des banques de données informatiques, l'analyse ADN peut être utilisée pour résoudre des crimes sans suspects. Les médecins légistes peuvent comparer les profils ADN d'échantillons de preuves biologiques avec une banque de données pour aider la police à détecter les suspects. Une banque de données permettrait également d'éclaircir les infractions antérieures non résolues pour lesquelles des preuves ADN ont été trouvées mais non liées au délinquant, si les échantillons d'ADN prélevés sur un suspect dans le cadre d'une infraction ultérieure correspondent aux preuves trouvées sur les lieux du crime antérieur. . Une banque nationale de données génétiques aiderait également la police à identifier les contrevenants en série à l'intérieur et à travers le pays.
L'analyse médico-légale de l'ADN est effectuée dans le monde entier. Par conséquent, il est impératif de la part des pays en développement, y compris la Malaisie, de développer et de compiler une base de données ADN nationale comprenant l'index de profil ADN de scène de crime ”, l'indice de profil ADN de délinquant condamné ” et un index contenant les profils ADN de corps et parties du corps non identifiés. Cet effort justifiera à son tour des modifications appropriées des lois pénales pour aider les organismes d'application de la loi à identifier les personnes soupçonnées d'avoir commis des infractions graves et violentes et autoriser la collecte d'échantillons pour la base de données de profilage ADN. À ce jour, il existe déjà des données publiées pour 9 STR pour trois groupes de population ethnique de Malaisie (Malais, Chinois et Indiens) (21, 22) et des efforts sont actuellement en cours pour saisir des sous-populations de Malais et pour commencer le profilage de 15 STR nouvellement validé. kit dans diverses populations en Malaisie. Une base de données étendue et le profilage ADN des criminels et leur indexation contribueront à accélérer la détection des crimes.
Comment fonctionnent les preuves ADN
De la scène du crime, une preuve ADN se rend dans un laboratoire médico-légal. Ces laboratoires varient beaucoup, à la fois en termes de structure et de type d'analyses qu'ils proposent. Les laboratoires publics sont souvent associés à une entité chargée de l'application de la loi ou au bureau du procureur de la République, tandis que d'autres sont des entités gouvernementales indépendantes. Des laboratoires médico-légaux privés, certains dédiés uniquement à l'analyse ADN, existent également.
De nombreux laboratoires ont la capacité d'effectuer des tests sur l'ADN nucléaire, qui est la copie de l'ADN qui existe dans le noyau de chaque cellule. Mais seuls quelques laboratoires proposent des techniques plus spécialisées, telles que l'analyse du chromosome Y ou de l'ADN mitochondrial. Examinons certaines de ces techniques plus en détail.
Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) a été l'une des premières méthodes médico-légales utilisées pour analyser l'ADN. Il analyse la longueur des brins d'ADN qui comprennent des paires de bases répétitives. Ces répétitions sont appelées répétitions en tandem à nombre variable (VNTR) car ils peuvent se répéter de 1 à 30 fois.
L'analyse RFLP nécessite que les enquêteurs dissolvent l'ADN dans une enzyme qui casse le brin à des points spécifiques. Le nombre de répétitions affecte la longueur de chaque brin d'ADN résultant. Les enquêteurs comparent les échantillons en comparant les longueurs des brins. L'analyse RFLP nécessite un échantillon assez important d'ADN qui n'a pas été contaminé par de la saleté.
De nombreux laboratoires remplacent l'analyse RFLP par répétition courte en tandem (STR) une analyse. Cette méthode offre plusieurs avantages, mais l'un des plus importants est qu'elle peut commencer avec un échantillon d'ADN beaucoup plus petit. Les scientifiques amplifient ce petit échantillon grâce à un processus connu sous le nom de réaction en chaîne par polymérase, ou PCR. La PCR fait des copies de l'ADN un peu comme l'ADN se copie lui-même dans une cellule, produisant presque n'importe quelle quantité désirée de matériel génétique.
Une fois que l'ADN en question a été amplifié, l'analyse STR examine la fréquence à laquelle les paires de bases se répètent dans des loci ou des emplacements spécifiques sur un brin d'ADN. Il peut s'agir de répétitions dinucléotidiques, trinucléotidiques, tétranucléotidiques ou pentanucléotidiques, c'est-à-dire des répétitions de deux, trois, quatre ou cinq paires de bases. Les enquêteurs recherchent souvent des répétitions de tétranucléotides ou de pentanucléotides dans les échantillons qui ont subi une amplification par PCR, car ce sont les plus susceptibles d'être précis.
Le Federal Bureau of Investigation (FBI) a choisi 20 loci STR spécifiques pour servir de norme pour l'analyse de l'ADN. Ils ont augmenté ce nombre de 13 à 20 en janvier 2017.
Typage STR : méthode et applications
L'incursion de ce mois-ci par The Primer dans les techniques de diagnostic moléculaire couvrira une méthode connue sous le nom de typage à répétition en tandem courte (STR). Le typage STR est une méthode la plus couramment appliquée pour les travaux de médecine légale moléculaire, mais elle est également de plus en plus utilisée dans le laboratoire de pathologie moléculaire comme méthode à utiliser (ou sur laquelle se replier, selon les besoins) pour le suivi et/ou la confirmation de « l'identité » du tissu échantillons. Alors que la première application obtient plus de temps d'écran à la télévision et au cinéma, c'est dans ce dernier contexte que davantage de lecteurs rencontreront probablement la méthode. Cependant, comme nous le verrons, la méthode actuelle est identique dans les deux utilisations.
Comprendre les répétitions courtes en tandem
Nous commençons par examiner ce qu'est réellement une STR. Dans le génome humain, il existe un grand nombre d'endroits (« loci ») où les séquences d'ADN non codantes consistent en un élément nucléotidique court (généralement 3 ou 4), tel que « CGG » ou « ACAG », qui se présente comme un ensemble de répétitions concatémères. Pour nos exemples, ce serait « CGGCGGCGG….CGG » et « ACAGACAGACAG….ACAG », respectivement. Lorsque la réplication de l'ADN se produit à travers ces types d'éléments, un type particulier d'erreur peut se produire : si le brin naissant (en croissance) se détache momentanément de la matrice, lorsqu'il se re-hybride, il peut effectivement le faire avec un « glissement » par une unité nombre de répétitions, permettant à la quasi-totalité de l'appariement de bases de se rétablir. C'est-à-dire qu'après dénaturation et réannelage du brin naissant à la matrice, la polymérase peut être « en avant » ou « en arrière » où elle se trouvait lorsqu'elle est partie. Au fur et à mesure que la réplication recommence, le brin naissant a alors "sauté" certaines des répétitions du modèle ou les a lues deux fois comme modèle. Le premier produit un brin d'ADN fille avec une perte d'un nombre d'unités de répétitions STR, tandis que le second produit un brin fille avec un nombre accru de répétitions STR.
À quelle fréquence ce « glissement » de la polymérase se produit-il dans une région STR ? La fréquence peut varier en fonction d'un certain nombre de facteurs, mais la réponse générale est : rare, mais suffisamment fréquemment pour qu'une population affiche une gamme de nombres de répétitions STR à un locus donné.
Alors que les loci STR sont dispersés dans tout le génome humain, un petit nombre est particulièrement bien compris. Ce sont celles qui se produisent dans une région flanquée de séquences uniques hautement conservées, de sorte que les séquences uniques ne sont pas trop proches les unes des autres, ni trop éloignées, pour une amplification PCR efficace basée sur des amorces contre les régions uniques (environ 50 à 500 bases paires). Lorsqu'un élément STR comme celui-ci existe, il est possible de concevoir des amorces PCR contre les régions conservées flanquantes et de savoir que (grâce à la conservation) l'ensemble d'amorces amplifiera un produit à partir de tout échantillon d'ADN humain intact. En fait, lorsque les loci STR en question sont sur un autosome comme la plupart le sont, alors un échantillon d'ADN humain aura deux copies de loci (une d'ADN d'origine maternelle, une d'origine paternelle), donc deux produits PCR seront amplifiés. Le détail important ici est que même si nous savons qu'un produit PCR (ou deux produits) se formera, nous ne savons pas a priori combien de temps les produits seront. Cette longueur dépendra du nombre de répétitions STR entre les sites d'amorce PCR. Les loci STR les plus utiles sont ceux où les études de population ont montré une grande diversité de nombre de répétitions rencontrées, disons 5 à 30. Cette plage de 25 « nombres de répétitions » pour un élément de répétition trinucléotidique conduirait à une plage de 75 paires de bases ( c'est-à-dire 25 x 3) de tailles d'amplicons possibles, par pas de trois bases par répétition.
Connus sous des noms de loci tels que "D1S80" ou parfois pour les gènes voisins "TPOX", une poignée particulière de loci STR répondent à ces critères d'utilité et sont bien étudiés, avec des ensembles d'amorces publiés pour leur amplification et des statistiques de population connues pour les nombres de répétitions individuels à chaque locus—c'est-à-dire, pour un locus, dans une population ethnique donnée, certains nombres répétés sont couramment trouvés, et d'autres sont moins fréquemment trouvés.
Trouver une empreinte ADN
Dans cet esprit, imaginez que nous prenons un jeu d'amorces pour un locus STR autosomique et effectuons une simple PCR à point final sur un échantillon humain. À la fin de la PCR, nous analysons la taille des produits PCR. Puisque nous recherchons des étapes de 3 ou 4 nt, l'électrophorèse sur gel ne nous donnera pas une résolution suffisante pour distinguer les produits différant par un ou deux nombres de répétition, nous utilisons donc des séquenceurs d'électrophorèse capillaire pour lire les tailles de produit exactement à la nucléotide. Notre échantillon peut montrer un produit de taille unique (indiquant que les deux copies de loci avaient le même numéro de répétition), ou il peut montrer deux produits, différant par des numéros de répétition (Figure 1). Pour les loci examinés, nous connaissons maintenant les numéros de répétition associés à cet échantillon d'ADN.
Imaginez maintenant que nous prélevons un deuxième échantillon d'ADN et répétons l'expérience. Si nous le faisons, et que nous obtenons un résultat différent de celui du premier échantillon, nous avons la conclusion inéluctable que les deux échantillons d'ADN proviennent d'individus différents. Si au contraire nous obtenons les mêmes résultats que le premier échantillon, nous ne pouvons cependant pas dire que les échantillons proviennent du même individu. C'est parce qu'il est possible (à un certain niveau statistique, selon la fréquence de population du résultat obtenu pour ce locus) qu'une autre personne ait les mêmes numéros de répétition que ces loci.
La technique gagne en puissance lorsque nous testons plusieurs loci STR dans chaque échantillon. La probabilité que deux échantillons correspondent exactement diminue rapidement à mesure que nous examinons plus de loci. Un test STR commercial couramment utilisé examine 16 loci (15 autosomiques et un cas particulier chromosomique sexuel discuté plus loin) avec des taux de spécificité revendiqués (c'est-à-dire la probabilité que deux individus correspondent à tous les loci) de 1 sur 1,8 × 10 17 individus ou plus— c'est-à-dire plusieurs fois la population humaine totale de la planète ! Communément appelée « empreinte ADN », avec des probabilités de cette échelle, il n'est pas étonnant que les preuves ADN soient de plus en plus utilisées à des fins médico-légales et criminelles, à la fois dans les divertissements populaires et dans la médecine légale réelle.
Des relations significatives
En plus de déterminer (ou de réfuter) l'identité entre deux échantillons, la technique peut également être utilisée pour déterminer la parenté. La moitié des numéros de répétition des loci STR d'un individu doit correspondre aux valeurs de la source maternelle et l'autre moitié de la source paternelle. Les frères et sœurs doivent généralement s'apparier sur un quart des loci, et ainsi de suite, à travers de simples relations génétiques mendéliennes. Une analyse statistique détaillée (y compris la fréquence de population des types particuliers de STR observés) peut être utilisée pour affiner les données de ce type et prouver ou réfuter les niveaux de parenté entre les échantillons, à une probabilité statistique connue. A noter que depuis de novo Des événements de glissement STR et/ou des erreurs expérimentales peuvent se produire, une seule inadéquation avec les valeurs attendues ne réfute pas définitivement la parenté, une correspondance entre les loci restants peut encore être suffisante pour avoir une certitude élevée de parenté.
Maintenant que nous comprenons comment cette méthodologie est appliquée aux applications populaires, qu'en est-il des plus banales ? La puissance et la simplicité de la méthode STR « d'empreintes digitales », combinées à sa disponibilité immédiate dans des formats de kits optimisés préfabriqués facilement exécutables sur des équipements de laboratoire déjà généralement présents dans le laboratoire de pathologie moléculaire, en font un outil utile pour le suivi et/ou la confirmation de la parenté en échantillons (ou morceaux d'échantillons). Considérons un cas tel qu'une biopsie tumorale potentielle, où plusieurs petits morceaux de tissu peuvent être intégrés dans un seul bloc FFPE. Une analyse immunohistochimique de routine est effectuée et le résultat montre que la plupart des morceaux de tissu sont non cancéreux, alors qu'un seul petit morceau l'est. Dans des cas comme celui-ci, une préoccupation qui traverse l'esprit du pathologiste peut être de savoir si tous les morceaux de tissu proviennent en fait du même échantillon ou si un « flotteur » d'un autre cas est entré d'une manière ou d'une autre dans le bloc ? Bien qu'ils soient soigneusement protégés, de tels cas ne sont pas impossibles et peuvent avoir de graves conséquences pour le patient. La méthode de typage STR peut être un outil très utile dans un cas comme celui-ci, où une section microscopique du morceau de tissu en question peut servir de modèle pour une empreinte ADN, avec un échantillon de référence du patient en fournissant une autre. Une correspondance confirme la « relation » (ou non) entre le morceau de tissu et le patient, assurant un diagnostic correctement attribué.
Un locus STR particulier sur les chromosomes sexuels a été évoqué ci-dessus. Se produisant au sein du gène de l'amélogénine, il ne s'agit pas strictement d'un STR classique où la taille d'un élément répété peut plutôt varier, il s'avère que la version du gène de l'amélogénine portée sur le chromosome X (AMELX deux fois chez les femmes et une fois chez les hommes) n'est pas exactement de longueur identique à la même région du gène de l'amélogénine portée sur le chromosome Y (AMELY une fois chez les mâles). Un intron dans AMELY contient une insertion de 6 bases par rapport au même intron dans AMELX. (Notez que puisque l'insertion est dans un intron, les portions de gène codant sont identiques.) Lorsqu'ils sont amplifiés par des amorces flanquant cette région, les produits dérivés d'AMELY sont donc 6 pb plus longs que ceux dérivés d'AMELX. L'ensemble d'amorces le plus couramment utilisé pour ce locus donne donc un seul produit de 106 pb (deux copies de loci, même taille) pour les échantillons d'ADN des femelles, et un produit doublet de 106/112 pb (un de chaque locus) des mâles. Ce test à locus unique exclut donc (ou exclut) environ la moitié de la population en tant que sources possibles pour un échantillon d'ADN donné, et est systématiquement inclus dans les panels de typage STR. Compte tenu de sa taille, ce locus est également à peine différentiable sur un gel d'agarose avec une bonne technique, ce qui en fait une bonne démonstration en classe de l'approche globale, sans avoir besoin d'accéder à un instrument séquenceur capillaire.
Qu'en est-il des échantillons mélangés ? La méthode décrite ci-dessus suppose que chaque échantillon testé provient d'une seule source et fonctionne mieux dans cette situation « parfaite ». Cependant, dans des cas réels avec de petites quantités proportionnelles d'autre ADN présent, la méthode fonctionne toujours. Le gabarit principal produira la majorité du produit, avec de petites quantités de produit provenant du gabarit contaminant. Les séquenceurs capillaires affichent la zone de pic réelle pour chaque produit détecté, de sorte que l'échantillon primaire montrera un ensemble important de pics avec de petits pics latéraux attribuables au contaminant.
Retourner à Figure 1: un croquis des résultats STR hypothétiques pour quatre marqueurs STR « A », « B », « C » et « D ». Les échantillons 1, 2 et 3 représentent trois échantillons différents testés pour ces marqueurs, comme les résultats bruts de l'électrophorèse capillaire. Chaque échantillon contient deux normes de taille fixe, « R1 » et « R2 », qui sont utilisées pour assurer l'alignement des résultats entre les échantillons. Chaque électrophérogramme lui-même montre la force du signal par rapport à la taille du produit et est divisé en régions « A », « B », « C » et « D ». Chaque région représente la plage attendue de tailles d'amplicons possibles à partir du marqueur STR du même nom. En considérant l'échantillon 1, on peut voir que la source est hétérozygote pour les tailles STR aux marqueurs A, C et D (deux produits distincts formés à des tailles spécifiques) mais est homozygote pour les deux allèles marqueurs B. (Il existe deux produits mais de taille identique, produisant un seul pic.) L'échantillon 2 aurait une très faible parenté génétique avec l'échantillon 1 notez que dans cet échantillon, les marqueurs STR B, C et D sont hétérozygotes tandis que A est homozygote, et que en général, peu de tailles d'allèles s'alignent entre les échantillons 1 et 2. En revanche, l'échantillon 3 est exactement le même que l'échantillon 1, suggérant une identité (ou au moins un degré élevé de parenté). Un vrai résultat STR ressemblerait à celui-ci mais avec plus de marqueurs, permettant une plus grande puissance statistique dans la détection de non-relation.
John Brunstein, PhD, membre du MLO Editorial Advisory Board, est président et CSO de PathoID, Inc., basé en Colombie-Britannique.
Rue Roepat - Histoire
La plupart de notre ADN est identique à l'ADN des autres. Cependant, il existe des régions héritées de notre ADN qui peuvent varier d'une personne à l'autre. Les variations de la séquence d'ADN entre les individus sont appelées "polymorphismes". Comme nous le découvrirons dans cette activité, les séquences avec le plus haut degré de polymorphisme sont très utiles pour l'analyse de l'ADN dans les affaires médico-légales et les tests de paternité. Cette activité est basée sur l'analyse de l'hérédité d'une classe de polymorphismes d'ADN appelés « Short Tandem Repeats », ou simplement STR.
Les STR sont de courtes séquences d'ADN, normalement de longueur 2 à 5 paires de bases, qui sont répétées de nombreuses fois de manière tête-queue, c'est-à-dire que la séquence de 16 pb de "gatagatagatagata" représenterait 4 copies tête-queue du tétramère "gata" . The polymorphisms in STRs are due to the different number of copies of the repeat element that can occur in a population of individuals.
D7S280
D7S280 is one of the 13 core CODIS STR genetic loci. This DNA is found on human chromosome 7. The DNA sequence of a representative allele of this locus is shown below. This sequence comes from GenBank, a public DNA database. The tetrameric repeat sequence of D7S280 is "gata". Different alleles of this locus have from 6 to 15 tandem repeats of the "gata" sequence. How many tetrameric repeats are present in the DNA sequence shown below? Notice that one of the tetrameric sequences is "gaca", rather than "gata".
TH01
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The Geriatric Patient
Steven J. Schwartz MD , Frederick E. Sieber MD , in Anesthesia and Uncommon Diseases (Sixth Edition) , 2012
Diagnosis and Differential
The DNA-repeat expansion forms the basis of a diagnostic blood test for the disease gene. Patients having 38 or more CAG repeats in the Huntington's disease gene have inherited the disease mutation and will eventually develop symptoms if they live to an advanced age. Each of their children has a 50% risk of also inheriting the abnormal gene a larger number of repeats is associated with an earlier age at onset. Huntington's can also be diagnosed by caudate atrophy on magnetic resonance imaging (MRI) in the context of an appropriate clinical history.
Differential diagnosis of Huntington's disease includes other choreas, hepatocerebral degeneration, schizophrenia with tardive dyskinesia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and other primary dementias and drug reactions.
Performing STR Analysis
This method differs from RFLP since in STR analysis DNA is not cut with restriction enzymes. Probes are attached to preferred regions on the DNA, and a PCR is employed to discover the lengths of the short tandem repeats.
The whole process for STR typing comprisesof collection of sample, extraction of DNA, quantisation of DNA, amplification of multiple STR loci by PCR, separation and sizing of STR allele, STR typing followed by profile interpretation, and possibly a report of the statistical significance of a match. Current forensic systems apply 10 (e.g. United Kingdom) or 13 (e.g. United States) STR loci. Kits with PCR primers for the standard STR loci are available commercially.
Numerous PCR reactions are performedconcurrently in a single tube at different STR loci, which give several products (two for each locus). The required components are as follows:
§ A DNA sample, e.g. blood or buccal cells from a suspect or a tissue, hair, nail from the scene of a crime
§ Two oligonucleotide PCR primers: one unlabelled reverse primer and one primer labelled at the 5 ′ -end with 32 P
§ A DNA polymerase (thermos table)
§ Four deoxynucleoside triphosphates which are as follows: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
The labelled PCR products separate according to size when run on a polyacrylamide gel. DNA ladder is obtained and works as characteristic of an individual (Fig.7) .
Repeat specific rows or columns on every printed page
If a worksheet spans more than one printed page, you can label data by adding row and column headings that will appear on each print page. These labels are also known as print titles.
Follow these steps to add Print Titles to a worksheet:
On the worksheet that you want to print, in the Page Layout tab, click Print Titles , dans le Mise en page grouper).
Noter: The Print Titles command will appear dimmed if you are in cell editing mode, if a chart is selected on the same worksheet, or if you don’t have a printer installed. For more information about installing a printer, see finding and installing printer drivers for Windows Vista. Please note that Microsoft has discontinued support for Windows XP check your printer manufacturer's Web site for continued driver support.
Sur le Feuille tab, under Print titles, do one—or both—of the following:
Dans le Rows to repeat at top box, enter the reference of the rows that contain the column labels.
Dans le Columns to repeat at left box, enter the reference of the columns that contain the row labels.
For example, if you want to print column labels at the top of every printed page, you could type $1:$1 dans le Rows to repeat at top box.
Tip: Vous pouvez également cliquer sur le Collapse Popup Window buttons at the right end of the Rows to repeat at top et Columns to repeat at left boxes, and then select the title rows or columns that you want to repeat in the worksheet. After you finish selecting the title rows or columns, click the Collapse Dialog button again to return to the dialog box.
Noter: If you have more than one worksheet selected, the Rows to repeat at top et Columns to repeat at left boxes are not available in the Mise en page boite de dialogue. To cancel a selection of multiple worksheets, click any unselected worksheet. If no unselected sheet is visible, right-click the tab of a selected sheet, and then click Ungroup Sheets on the shortcut menu.
